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膽紅素氧化酶 |
| CAS No.: |
80619-01-8 |
| 分子式： |
N/A |
| 分子量： |
74.92 |
| 備注： |
中文名稱膽紅素氧化酶中文同義詞膽紅素氧化酶,10單位/每毫克蛋白;BILIRUBINOXIDASE膽紅素氧化酶;膽紅素氧化酶;膽紅素氧化酶,≥50U/MGPROTEIN;膽紅素氧化酶/BOD英文名稱BILIRUBINOXIDASE英文同義詞BILIRUBIN:OXYGENOXIDOREDUCTASE;bilirubinoxidasefrommyrotheciumverrucaria;BILIRUBINOXIDASE,FROMMYROTHECIUMSP.;frommyrotheciumspecieslyophilizedpowder0;Oxidase,bilirubin;BilirubinOxidase[≥50units/mg];BilirubinOxidase[>=10units/mg];BilirubinoxidaseAmano3CAS號80619-01-8分子式N/A分子量0EINECS號相關(guān)類別酶類;生化試劑-酶類;化學(xué)試劑;生化試劑-酶和輔酶Mol文件MolFile結(jié)構(gòu)式膽紅素氧化酶性質(zhì)儲存條件-20°C形態(tài)凍干粉顏色淺藍(lán)至藍(lán)色CAS數(shù)據(jù)庫80619-01-8膽紅素氧化酶用途與合成方法背景介紹膽紅素是動物體內(nèi)含鐵卟啉化合物進(jìn)行正常分解代謝的產(chǎn)物，是鐵葉琳化合物在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一。膽紅素在體內(nèi)起著重要的作用，它是一種抗氧化劑，有助于肝細(xì)胞的再生。但是，一旦出現(xiàn)代謝異常，膽紅素就會在體內(nèi)積累，形成高膽紅素血癥，甚至黃疸。凡能引起膽紅素生成過多或使肝細(xì)胞對膽紅素的攝取、結(jié)合和排泄過程發(fā)生障礙，都會使血中的膽紅素濃度升高，出現(xiàn)高膽紅素血癥。因此，膽紅素的測定對臨床檢測肝膽疾病、溶血等具有重要的意義。膽紅素氧化酶（bilirubin：oxygenoxidoreductase，EC1.3.3.5，BOD/Br/BOX）是一種多酚氧化酶，最開始對膽紅素氧化酶進(jìn)行研究的是國外的兩名學(xué)者M(jìn)urao和Tanaka，他們從漆斑菌屬真菌中純化出膽紅素氧化酶，為后來膽紅素氧化酶的各項研究及應(yīng)用奠定了重要理論基礎(chǔ)。膽紅素氧化酶的來源特別廣泛，漆斑菌屬是其主要來源和高產(chǎn)菌，產(chǎn)生膽紅素氧化酶的微生物有鏈霉菌屬、弗蘭克氏菌、粗皮靈芝、微紫青霉菌等；Maitins在研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、芽孢外衣蛋白也有膽紅素氧化酶活性；此外，國外科研人員在馬鈴薯洋蔥苜蓿和番茄等植物中也都陸續(xù)分離出膽紅素氧化酶。膽紅素氧化酶能催化膽紅素反應(yīng)生成無毒害作用的膽綠素，主要被用于測定血清中膽紅素的含量，而血清中膽紅素含量的多少可以作為肝膽病情診斷的重要依據(jù)，也能為病理分析提供信息。結(jié)構(gòu)特點膽紅素氧化酶全酶是由蛋白質(zhì)、二價銅離子和部分碳水化合物組成。蛋白質(zhì)由17種氨基酸組成，不含半胱氨酸、賴氨酸和蛋氨酸含量較低，每個分子中不到10個殘基；天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量較高，每個分子中的殘基數(shù)超過40個。膽紅素氧化酶的前體是由572個氨基酸殘基組成，包括534個氨基酸和38個氨基酸的前導(dǎo)區(qū)。前導(dǎo)區(qū)中碳末端的個疏水氨基酸與已知信號肽特征相似，可能也起著信號肽的作用。膽紅素氧化酶（BOD）的光譜學(xué)特性與多銅氧化酶基本相似，純化后的BOD常呈深藍(lán)色，BOD中含有的銅離子依光譜學(xué)和磁學(xué)特性被分為3種類型，T1銅中心接受來自于酶的有機底物電子供體如膽紅素并將所得電子傳遞到O2還原位點，目前被廣泛接受的觀點是該蛋白的紫外-可見光譜在約600nm處有一強吸收T1銅特征吸收峰，這主要源于酶底物中的電荷從Cys-S到T1CuII的傳遞繼而電子再被傳遞至O2還原位點，這一位點由1個三核中心組成，包含1個具有電子順磁共振活性的T2Cu2+中心和一對逆磁性與羥基耦合的T3銅離子該三核銅中心，，在UV-Vis區(qū)約330nm處有一明顯的寬肩作為其特征，2010年億報道從M．verrucarria分離純化并獲得首個BOD晶體結(jié)構(gòu)，此后有關(guān)此酶晶體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究也陸續(xù)被報道。催化機制膽紅素氧化酶是一種含銅的多酚氧化酶，它包含三種類型的銅離子。一個I型銅離子介導(dǎo)電子從底物傳到其他銅位點，氧分子束縛在一個II型銅離子和兩個III型銅離子形成三核中心上，被還原為兩個水分子。所以其催化過程是利用分子氧作為電子受體，有水生成的氧化反應(yīng)。經(jīng)電子吸收光譜及薄層色譜技術(shù)測定，具體反應(yīng)為，過程為膽紅素氧化酶催化膽紅素生成膽綠素，后者進(jìn)一步氧化生成部分性質(zhì)還不明確的無色物質(zhì)。研究表明膽紅素氧化酶的催化機制是對于被束縛在蛋白質(zhì)上銅離子的二級反應(yīng)，供體結(jié)構(gòu)為CuSS*N2(S=Cys，S*=Met，N=His)類型，和銅藍(lán)蛋白家族相同（如下圖）。在對黃疽血液進(jìn)行膽紅素氧化酶反應(yīng)中，用HPLC法測定血液中膽紅素濃度在用膽紅素氧化酶催化后的變化，發(fā)現(xiàn)膽紅素氧化酶可以氧化結(jié)合型膽紅素，也可以氧化非結(jié)合型膽紅素。在ph=5.5和氟化鈉等試劑存在時，膽紅素氧化酶能選擇性地氧化結(jié)合型膽紅素。這種方法能被用于檢測病人血清中結(jié)合膽紅素濃度的變化。最適溫度及穩(wěn)定性膽紅素氧化酶（BOD）酶活與溫度沒有明顯的相關(guān)關(guān)系。M.oryzaeBOD酶活最高溫度為60℃，CotABOD酶活最高溫度達(dá)80℃，而來自M．verrucarria的BOD酶活最高溫度只有40℃。在多銅氧化酶家簇中CotA蛋白具有最高的熱穩(wěn)定性，在80℃下半衰期100min，而表現(xiàn)出細(xì)菌蛋白酶的顯著特性。目前對此現(xiàn)象的解釋有2種，1種使這種蛋白分子的結(jié)構(gòu)較其他蛋白更加緊密，另一種是通過蛋白晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)這種蛋白中的銅被埋在蛋白質(zhì)更深的結(jié)構(gòu)里所致。在真菌BOD中來源于M.oryzae的BODChemicalbook是目前發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的一個，其半衰期在37℃下300min，在60℃下70min，相比之下自然分泌的M．verrucarriaBOD在60℃下的半衰期只有15min，而其在Pachiapastoris中表達(dá)的重組蛋白半衰期在相同溫度下可達(dá)90min。來自T．tsunodae的BOD14在37℃下90min后酶活喪失50％，與漆酶不同BODs在中性條件下穩(wěn)定如來自于M.oryzae的BOD在生理條件下孵育8d只喪失15％的酶活性。應(yīng)用用于臨床檢測和治療膽紅素氧化酶在醫(yī)學(xué)方面的用途廣泛，主要用來測定血清中測定膽紅素和總膽紅素的含量，對肝膽疾病的監(jiān)測比化學(xué)方法更為敏感準(zhǔn)確，從而為病理分析提供詳細(xì)信息。為了方便測定，現(xiàn)已將膽紅素氧化酶制成試劑盒，在臨床上能夠快速測定病人的膽紅素含量，并診斷黃疸水平此外，重度黃疸病患者在臨床治療時需要測定病人血清中的肌酐，但是在測定過程中會受到血清中膽紅素的干擾，而膽紅素氧化酶恰好可以用來消除血清中膽紅素的干擾，從而保證肌酐測定的正常進(jìn)行和提高數(shù)值的可靠性。膽紅素氧化酶是一種胞外酶，不容易分離，并且在分離純化的過程中，性質(zhì)不穩(wěn)定，酶活會大大降低，降低了產(chǎn)量為了克服以上問題，我們可以將酶進(jìn)行固定，固定后的酶其性質(zhì)更加穩(wěn)定，能夠提高酶的催化效率，并且易于調(diào)節(jié)和控制酶反應(yīng)，還可以減少使用過程中的有害作用，治療效果更好用于環(huán)境污水的處理隨著工業(yè)的快速發(fā)展，越來越多的化工及印染廢水排到環(huán)境中，造成一定的污染一直以來，處理廢水的方法主要是物理法和化學(xué)法，物理法處理污水速度慢周期長，化學(xué)處理也不盡人意。隨著對酶的深入研究，生物法處理污水成為可能膽紅素氧化酶和漆酶都是多酚氧化酶類，因此具有相似的性質(zhì)和作用。漆酶的應(yīng)用范圍很廣，這也為膽紅素氧化酶的應(yīng)用研究指明了方向。漆酶主要用于工業(yè)染料的降解方面，膽紅素氧化酶也具有染料脫色作用，在染整工業(yè)中，酸性靛藍(lán)的作用是進(jìn)行棉纖維的脫色，使用過程中會產(chǎn)生大量含酸性靛藍(lán)染料的廢水，給環(huán)境造成污染通過研究，漆斑菌發(fā)酵產(chǎn)生的膽紅素氧化酶能夠?qū)θ玖纤嵝缘逅{(lán)進(jìn)行降解。此外，經(jīng)疣孢漆斑菌產(chǎn)生的膽紅素氧化酶可以高效降解染料靛紅，顯示出膽紅素氧化酶在污水處理和環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用前景。用于生物電池的制造隨著環(huán)境能源問題的日益突出，開發(fā)綠色無污染可再生的生物能源一直備受關(guān)注。膽紅素氧化酶可以被固定在電極上，制成生物燃料電池。生物燃料電池（biologicalfuelcell，BFC）是由天然的酶作為催化劑或者通過生化過程中的電化學(xué)反應(yīng)將化學(xué)能直接轉(zhuǎn)變?yōu)殡娔艿囊环N特殊的生物電池，特點是：染料來源廣泛反應(yīng)條件溫和生物相容性好。酶處于游離狀態(tài)時性質(zhì)不穩(wěn)定，容易失活，因此，一般將酶固定在電極上，以提高酶的使用效率。近年來研究較多的是將酶固定在聚吡咯聚苯胺等聚合物膜上，Halliwell等研究人員在碳電極上覆蓋一種聚苯胺膜，再將其浸在酶液中，制成生物催化電極。隨著對酶固定載體的研究，將酶固定在能導(dǎo)電的聚合物上，這樣，可以極大地縮小生物電池的體積，為在人體內(nèi)植入動力裝置提供可能。但是，又出現(xiàn)了一個新的問題，內(nèi)置電池必須在人體生理條件下工作，對此，Mano等研制了一種聚陽離子膜，這種膜是聚丙烯酰胺和聚［氮-乙烯基咪唑］螯合另一種物質(zhì)得到的，這種電池當(dāng)膽紅素氧化酶在人體生理條件下電流密度可以超過2mAcm-2，并且更加穩(wěn)定。在近幾年的研究中，電極不再使用復(fù)合物膜，而是碳纖維，從而使得電池體積進(jìn)一步縮小（如圖）。分離純化露濕漆斑菌產(chǎn)生的膽紅素氧化酶粗酶液通過硫酸銨沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow和SephadexG-100純化，得到純化152.54倍膽紅素氧化酶，得率19.14%。酶的分離與純化過程為：1）硫酸銨鹽析、透析：菌種在28℃下、PDB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)5d后，經(jīng)8層紗布過濾，6000r/min離心20min，所得上清液冷凍過夜，解凍除去沉淀，上清液即為粗酶液。80%飽和度硫酸銨沉淀，4℃靜置過夜。10000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀溶解于蒸餾水中，對其透析過夜。2）DEAE-SepharoseFastFlow柱層析：將上述所得酶液加到已用0.01mol/L磷酸鈉緩沖液（PBS7.0）平衡過的DEAE-SepharoseFastFlow柱（1.8cm×20cm），先用PBS洗柱，后改用含0～0.5mol/LNaCl的PBS梯度洗脫，合并有酶活組分，將所得溶液冷凍干燥成粉。3）SephadexG-100柱層析：將上述所得活力組分的凍干粉溶解于3mL蒸餾水中，所得酶液加到平衡好的層析柱（2.0cm×80cm）上，用上述緩沖液洗脫，收集活力較高的組分，并將其凍干，溶解在2mL的蒸餾水中，-20℃下保存。主要參考資料[1]蔣帥等.膽紅素氧化酶的應(yīng)用研究進(jìn)展.黑龍江醫(yī)藥.2011,24(6):939-940.[2]韓旭等.膽紅素氧化酶的研究進(jìn)展.黑龍江醫(yī)藥.2009,22(6):791-793.[3]黃世臣等.膽紅素氧化酶的特性及應(yīng)用研究綜述.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報.2014,36(1):78-86.[4]車暢等.膽紅素氧化酶的生物電催化.黑龍江醫(yī)藥.2013,26(2):193-195.[5]蔣帥等.膽紅素氧化酶的應(yīng)用研究進(jìn)展.黑龍江醫(yī)藥.2011,24(6):939-940.[6]張曦等.膽紅素氧化酶電化學(xué)的應(yīng)用.黑龍江醫(yī)藥.2013,26(22):203-205.[7]劉友勛等.露濕漆斑菌膽紅素氧化酶的分離純化及其性質(zhì).食品與生物技術(shù)學(xué)報.2008,27(3):104-108.用途生化研究 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